SulfoLink Coupling Resin是一類預(yù)活化樹脂，可以通過與巰基或者氨基的反應(yīng)實(shí)現(xiàn)抗原的固定化，進(jìn)而對(duì)免疫血清中的抗體進(jìn)行純化。

產(chǎn)品性能：

純化流程

SulfoLink Coupling Resin 針對(duì)巰基和氨基的偶聯(lián)條件有所差異，對(duì)于含有巰基抗原偶聯(lián)請(qǐng)參考1.1 流程，對(duì)于含有氨基抗原偶聯(lián)請(qǐng)參考1.2 流程。

1.1含巰基抗原的偶聯(lián)流程

1.1.1緩沖液準(zhǔn)備

所用水和Buffer 在使用之前建議用0.22 μm 或0.45 μm 濾膜過濾。

偶聯(lián)液：50 mMTris，5 mMEDTA-Na，pH 8.5

封閉液：50 mMTris，5 mMEDTA-Na，50 mML-半胱氨酸，pH 8.5

保護(hù)液：20 mM 磷酸鹽緩沖液，20% 乙醇，pH 8.0

結(jié)合/洗雜液： 20 mM 磷酸鹽緩沖液，pH 8.0

洗脫液：100 mM 甘氨酸，pH 2.5-3.0

中和液：1 M Tris-HCl， pH 8.5

1.1.2抗原準(zhǔn)備

抗原樣品使用前務(wù)必確保其巰基處于還原狀態(tài)（可以使用Ellman’s Reagent 檢測自由巰基的含量）。如果巰基已經(jīng)氧化，必須對(duì)抗原進(jìn)行還原，一般推薦使用還原劑TCEP（Tris(2-carboxyethyl) phosphine），TCEP 溶液很穩(wěn)定，可以選擇性的、高效的打開抗原中的二硫鍵，并且不影響抗原與樹脂的偶聯(lián)反應(yīng)，每毫克抗原中TCEP 的添加量不超過12mg，需要自己進(jìn)行優(yōu)化。如果使用DTT 等含有巰基的還原劑，處理完樣品必須要將還原劑去除，否則會(huì)影響抗原與樹脂的偶聯(lián)效率。使用偶聯(lián)液溶解抗原，制備成終濃度為1-3 mg/ml 的抗原溶液。建議該溶液現(xiàn)用現(xiàn)配，儲(chǔ)存時(shí)間過長會(huì)影響偶聯(lián)效果。

1.1.3抗原偶聯(lián)

1) 取適量的SulfoLink Coupling Resin，加入合適的重力柱中，靠重力流干保護(hù)液，用3倍柱體積的偶聯(lián)液平衡樹脂，待偶聯(lián)液流干，再加入3 倍柱體積的偶聯(lián)液，重復(fù)操作2遍。共使用9 倍柱體積的偶聯(lián)液。

2) 關(guān)閉柱子的下端出口，加入等體積的含巰基的抗原，混勻，取出至于合適的離心管中，置于28℃震蕩孵育30min。

注：確保樹脂充分懸浮起來，否則將大大影響偶聯(lián)效率。

3) 將上述反應(yīng)體系取出，轉(zhuǎn)移至重力柱中，流干其中溶液，并收集流出，再用3 倍柱體積的偶聯(lián)液清洗樹脂，合并兩次流出。

注：如有需要，可以使用Ellman’s Reagent 檢測其中巰基含量，得出抗原殘留量，從而計(jì)算偶聯(lián)效率。

4) 關(guān)閉柱子的下端出口，加入等體積的封閉液，混勻，轉(zhuǎn)移至合適的離心管中，置于28℃震蕩孵育30min。

5) 將上述反應(yīng)體系取出，轉(zhuǎn)移至重力柱中，流干其中的封閉液。

注：如果立即使用，可以參考1.1.4 操作。如果以后使用，可以用3 倍柱體積的結(jié)合液清洗樹脂，然后保存在等體積的保護(hù)液中，于2℃-8℃保存。

1.1.4抗體純化

1) 將偶聯(lián)了抗原的樹脂裝入合適的層析柱，用5 倍柱體積的結(jié)合液進(jìn)行平衡，使填料處于與抗體更易結(jié)合環(huán)境中，一方面保護(hù)目標(biāo)抗體，另一方面提高抗體結(jié)合效率。

2) 將含有抗體的樣品加到平衡好樹脂中，為了保證抗體與樹脂充分接觸，提高目標(biāo)抗體的回收率，可以控制上樣流速在0.5-1 ml/min，并收集流出液。

3) 用10-15 倍柱體積的洗雜液進(jìn)行清洗，去除非特異性吸附的雜蛋白，提高目的抗體的純度，收集洗雜液。

4) 使用5-10 倍柱體積的洗脫液，收集洗脫組分，即目的抗體。

注：為了保持抗體活性，需要立即將洗脫組分透析至pH 7.0-8.0 的緩沖液中，或者先加入1/10倍洗脫組分體積的中和液，將洗脫組分進(jìn)行中和，再透析。

5) 依次使用3 倍柱體積的結(jié)合液和5 倍柱體積的去離子水平衡樹脂，最后再用5 倍柱體積的保護(hù)液平衡，然后保存在等體積的保護(hù)液中，置于2℃-8℃保存，防止填料被細(xì)菌污染。

1.2含氨基抗原偶聯(lián)流程

1.2.1緩沖液準(zhǔn)備

所用水和Buffer 在使用之前建議用0.22 μm 或0.45 μm 濾膜過濾。

偶聯(lián)液：0.1MNaHCO3，0.5MNaCl，pH 8.5

封閉液：50 mMTris， 5 mMEDTA-Na， 50 mML-半胱氨酸，pH 8.5

保護(hù)液：20 mM 磷酸鹽緩沖液，20% 乙醇，pH 8.0

結(jié)合/洗雜液: 20 mM 磷酸鹽緩沖液，pH 8.0

洗脫液: 100 mM 甘氨酸，pH 2.5-3.0

中和液：1 M Tris-HCl， pH 8.5

1.2.2抗原準(zhǔn)備

氨基是一種比較穩(wěn)定的基團(tuán)，所以，對(duì)于含有氨基的抗原沒有太特殊的要求。使用偶聯(lián)液溶解抗原，制備成終濃度為5-10 mg/ml的抗原溶液。

1.2.3抗原偶聯(lián)

1) 取適量的SulfoLink Coupling Resin，加入合適的重力柱中，靠重力流干保護(hù)液，用3倍柱體積的偶聯(lián)液平衡樹脂，待偶聯(lián)液流干，再加入3 倍柱體積的偶聯(lián)液，重復(fù)操作2遍。共使用9 倍柱體積的偶聯(lián)液。

2) 關(guān)閉柱子的下端出口，加入等體積的含氨基的抗原，混勻，取出轉(zhuǎn)移至合適的離心管中，置于28℃震蕩孵育3-5 小時(shí)，或者2-8℃震蕩孵育過夜（12-15 小時(shí)）。

注：確保樹脂充分懸浮起來，否則將大大影響偶聯(lián)效率。

3) 將上述反應(yīng)體系取出，轉(zhuǎn)移至重力柱中，其中的抗原溶液，并收集流出，再用3 倍柱體積的偶聯(lián)液清洗樹脂，合并兩次流出，留待測試。

4) 關(guān)閉柱子的下端出口，加入等體積的封閉液，混勻，取出轉(zhuǎn)移至合適的離心管中，置于28℃震蕩孵育30min。

5) 將上述反應(yīng)體系取出，轉(zhuǎn)移至重力柱中，流干其中的封閉液。

注：如果立即使用，可以參考1.2.4 操作。如果以后使用，可以用3 倍柱體積的結(jié)合液清洗樹脂，然后保存在等體積的保護(hù)液中，于2℃-8℃保存。

1.2.4抗體純化

1) 將偶聯(lián)了抗原的樹脂裝入合適的層析柱，用5 倍柱體積的結(jié)合液進(jìn)行平衡，使填料處于與抗體更易結(jié)合環(huán)境中，一方面保護(hù)目標(biāo)抗體，另一方面提高抗體結(jié)合效率。

2) 將含有抗體的樣品加到平衡好樹脂中，為了保證抗體與樹脂充分接觸，提高目標(biāo)抗體的回收率，可以控制上樣流速在0.5-1 ml/min，并收集流出液。

3) 用10-15 倍柱體積的洗雜液進(jìn)行清洗，去除非特異性吸附的雜蛋白，提高目的抗體的純度，收集洗雜液。

4) 使用5-10 倍柱體積的洗脫液，收集洗脫組分，即目的抗體。

注：為了保持抗體活性，需要立即將洗脫組分透析至pH 7.0-8.0 的緩沖液中，或者先加入1/10倍洗脫組分體積的中和液，將洗脫組分進(jìn)行中和，再透析。

5) 依次使用3 倍柱體積的結(jié)合液和5 倍柱體積的去離子水平衡樹脂，最后再用5 倍柱體積的保護(hù)液平衡，然后保存在等體積的保護(hù)液中，置于2℃-8℃保存，防止填料被細(xì)菌污染。

1.3 SDS-PAGE檢測

將純化抗體樣品得到的流出組分、洗雜組分和洗脫組分以及原始含抗體樣品使用SDS-PAGE檢測純化效果。

問題及解決方案

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標(biāo)題:PTX promotes breast cancer migration and invasion by recruiting ATF4 to upregulate FGF19

成員:Ting Xue, Xuezhen Wang, Xianjun Pan, Mei Liu, Faliang Xu

論文因子:4.4 發(fā)表期刊:CELLULAR SIGNALLING pmid:39053672

注意：以上文獻(xiàn) 僅供參考

SulfoLinkCouplingResin

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