注意：本產(chǎn)品試劑組分和操作步驟發(fā)生變化，使用前請仔細閱讀說明書。 

保存：本產(chǎn)品對光敏感，應該室溫避光儲存，保質期 2 年。無菌開封后，保存于室溫。 

試劑盒組成： 

試劑 A 200mL 室溫避光 

試劑 C 100mL 室溫避光 

紅細胞沉降液 100mL 室溫 

細胞洗滌液 200mL 室溫 

操作步驟一： 紅細胞沉降（僅供參考） 

沉降去除紅細胞：取骨髓單細胞懸液與血液稀釋液(注射用生理鹽水或 1×PBS)及紅細胞沉降液按 照 1:1:1 比例混勻，室溫下靜置 30-40min 后，可見紅細胞沉于試管底部，小心吸取上清層(富含白 細胞及血小板)用于后續(xù)細胞分離。 

操作步驟二： 

樣本分離（僅供參考） 

1. 樣本分離：當樣本體積小于 5mL 時,先在離心管中先加入 4mL 試劑 A，后將 2mL 試劑 C 小心疊加于試劑 A 之上，形成梯度界面(樣本體 積大于等于 5mL，試劑 A 與試劑 C 比例 2:1，試劑總量等于沉降后樣 本含量),將懸液小心平鋪于分離液液面上方。由于密度差異，可見明 顯的分層界面(注意二者的總體積不能超過離心管的三分之二，否則會 影響分離效果)。 

2. 室溫條件下水平轉子 600-1000g ，25-30min(血液體積越大所需離 心力越大,離心時間越長,最佳分離條件需摸索，離心最大轉速不超過 1000g)。

3. 離心后，離心管中可見兩個環(huán)狀乳白色層，上層為單個核細胞層,下層即所需中性粒細胞層(受 個體差異及分離條件影響，粒細胞白膜層可能會出現(xiàn)顏色較淺的情況)。 

4. 用吸管吸取下層中性粒細胞白膜層至新的離心管中，加入 10mL 細胞清洗液洗滌細胞，250g，離 心 10min。 

5. 棄上清,加入 5mL 細胞清洗液重懸細胞,250g，離心 5min。 

6. 棄上清，重懸細胞備用。 

骨髓單細胞懸液制備： 

小動物骨髓的采集： 

1. 處死動物，無菌提取股骨和脛骨，剪去兩端軟骨，露出紅色的骨髓腔（注意盡可能少的剪走骨 髓腔）。 

2. 取 1ml 的無菌注射器，吸取少量的含有 10%標準胎牛血清的稀釋液或者是含有血清的培養(yǎng)基，沖 洗骨髓腔以獲得骨髓。 

3. 最終制備成 2×10 8–1×10 9 /ml 的單細胞懸液備用。 

大動物骨髓的采集： 

大動物骨髓的采集可采取活體穿刺方法：先將動物麻醉、固定、局部除毛、消毒皮膚，然后估計好 皮膚到骨髓的距離，把骨髓穿刺針的長度固定好。操作人員用左手把穿刺點周圍的皮膚繃緊，右手 將穿刺針在穿刺點垂直刺入，輕輕左右旋轉將穿刺針鉆入，當穿刺針進入骨髓腔時常有落空感。連 接注射器緩慢抽吸骨髓組織，當注射器內抽到少許骨髓時即停止抽吸。用含 10%標準胎牛血清的稀 釋液調整細胞濃度為 2×10 8–1×10 9 /ml 的單細胞懸液備用。 

常用的骨髓穿刺點： 

股骨：穿刺部位在股骨內側面,靠下端的凹面處； 

胸骨：穿刺部位是胸骨體與胸骨柄連接處； 

肋骨：穿刺部位是第 5～7 肋骨各點的中點； 

脛骨：穿刺部位是股骨內側、靠下端的凹面處。

如果穿刺采用的是肋骨，穿刺結束后要用膠布封貼 穿刺孔，防止發(fā)生氣胸。 

注意事項： 

A.開封前顛倒混勻，本分離液為無菌產(chǎn)品，為延長分離液保存時間，請在無菌條件下啟封，避免 微生物污染。 

B.分離液使用時應始終保持室溫（18℃~25℃），如室內溫度較低，可將分離液預熱。4℃或者是 溫度較低的條件下離心，可能會導致白膜層不清晰。 

C.血液樣本最好為新鮮抗凝血（采血 2h 以內），為保持中性粒細胞的活性，應避免冷凍和冷藏。 

D.稀釋血液或洗滌細胞，不可使用含 Ca、Mg 離子的緩沖液及培養(yǎng)液，其成分會導致血細胞凝集， 大大降低細胞得率及純度。

E.部分塑料制品（如聚苯乙烯）因其帶有的靜電作用，可能會導致細胞掛壁，影響分離效果。 

F.血液樣本的粘稠度或者是溫度差異，可能會影響分離效果，可以調節(jié)離心轉數(shù)和離心時間，摸索 最佳的分離條件。 

G.如果要進一步對分離的細胞進行培養(yǎng)，注意全程保持無菌操作，避免微生物污染。 

H.不同動物血液在不同比重分離液中的細胞離散系數(shù)及細胞帶電不同，用戶在制定分離液時應提 供所需分離液的比重、動物種屬及被分離細胞的名稱。

羊骨髓中性粒細胞分離液試劑盒

羊骨髓中性粒細胞分離液試劑盒