Ni-NTA瓊脂糖凝膠6FF是用于純化6×His標(biāo)簽重組蛋白的一種純化介質(zhì)，它是由6%交聯(lián)的Sepharose耦連了一種四齒螯合劑NTA而得. 它可用于在非變性或變性條件下純化任何表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的6×His標(biāo)簽重組蛋白。NTA，含有四個(gè)螯合區(qū)，較一般的三齒螯合劑能更好的結(jié)合Ni2+。6×His可與Ni2+螯合，從而使His標(biāo)簽蛋白結(jié)合在Ni-NTA純化介質(zhì)上，未結(jié)合的蛋白被洗滌下去，結(jié)合在介質(zhì)上的蛋白經(jīng)過一定濃度的咪唑或低pH緩沖液的溫和洗脫下來，從而得到高純度的目的蛋白。該純化介質(zhì)與His標(biāo)簽蛋白具有極高的親和力，可達(dá)5-20 mg/ml?？稍诜亲冃院妥冃詶l件下純化任何表達(dá)系統(tǒng)所得的His標(biāo)簽蛋白。純化程序簡單，所得的蛋白純度可高達(dá)95％。Ni-NTA可再生4-6次，重復(fù)使用。本產(chǎn)品懸浮液為20％乙醇，已螯合Ni2+。

操作方法：

A. 非變性條件下抽提His標(biāo)簽蛋白

1) 準(zhǔn)備細(xì)胞，接種，誘導(dǎo)表達(dá)。收集細(xì)胞，置于-70°C或立即進(jìn)行步驟2操作。

2) 加入1/20細(xì)胞生長體積的NTA-0 Buffer和PMSF。PMSF使用的工作濃度為1 mM現(xiàn)用現(xiàn)加。

3) 將細(xì)胞懸浮起來，加入溶菌酶，混勻，冰上放置30分鐘，超聲或勻漿破碎細(xì)胞。該步驟冰上操作。

4) 加入10% Triton X-100, 使終濃度為0.05%，充分混勻，冰上放置15分鐘。

5) 12000 rpm/min(20,000×g以上)，4°C離心15分鐘以上。取上清，置于冰上備用或-20°C保存。

6) 將NTA樹脂裝入合適的層析柱，層析用10倍NTA體積的NTA-0 Buffer洗。

7) 將樣品加至NTA層析柱中，流速在15 ml/h左右，收集穿透部分，用SDS/PAGE分析蛋白的結(jié)合情況。

8) 層析用5倍NTA體積的NTA-0 Buffer洗，流速控制在30 ml/h左右。

9) 分別用5倍NTA體積的NTA-20、NTA-40、NTA-60、NTA-80、NTA-100、NTA-200、NTA-1000 Buffer洗脫，流速控制在15 ml/h左右，收集洗脫液，每管收集一個(gè)NTA體積。

10) 確定目標(biāo)蛋白質(zhì)在洗脫液中的分布情況。最為有效的方式是SDS-PAGE分析。也可以用Bradford 蛋白質(zhì)測定試劑盒，快速確定蛋白質(zhì)的含量，然后用SDS/PAGE分析蛋白質(zhì)的分布。

11)純化的目標(biāo)蛋白質(zhì)的保存條件需要根據(jù)蛋白質(zhì)的性質(zhì)和用途確定。  NTA-0 、20、40、60、80、100、200、1000Buffer分別為濃度20 mM Tris-HCl pH7.9, 0.5 M NaCl, 10% Glycerol，添加0、20、40、60、80、100、200、1000 mM Imidazole。

B.變性條件下從包涵體中純化His標(biāo)簽蛋白

1) 準(zhǔn)備細(xì)胞，接種，誘導(dǎo)表達(dá)。收集細(xì)胞，置于-70°C或立即進(jìn)行步驟2操作。

2) 加入1/20細(xì)胞生長體積的GuNTA-0 Buffer和PMSF。PMSF使用的工作濃度為1 mM現(xiàn)用現(xiàn)加。

3) 將細(xì)胞懸浮起來，冰上超聲破碎細(xì)胞，降低粘稠度。

4) 室溫放置30分鐘，間或混勻或用磁力攪拌。

5) 12000轉(zhuǎn)/分（20,000×g以上），4°C離心15分鐘以上。取上清，置于冰上備用或-20°C保存。

6) 將NTA樹脂裝入合適的層析柱，層析用10倍NTA體積的GuNTA-0 Buffer洗。

7) 將樣品加到NTA層析柱中，流速控制在15 ml/h左右，收集穿透部分，用于SDS/PAGE分析蛋白質(zhì)的結(jié)合情況。

8) 層析用5倍NTA體積的GuNTA-0 Buffer洗，流速控制在30 ml/h左右。

9) 分別用5倍NTA體積GuNTA-20、GuNTA-40，GuNTA-60、GuNTA-100、GuNTA-500洗脫，流速在15 ml/ h左右，收集洗脫液，每管收集一個(gè)NTA體積。

10) 確定目標(biāo)蛋白質(zhì)在洗脫液中的分布情況。最為有效的方式是SDS/PAGE分析。也可以用Bradford 蛋白質(zhì)測定試劑盒，快速確定蛋白質(zhì)的含量，然后用SDS/PAGE分析蛋白質(zhì)的分布。

11) 目標(biāo)蛋白質(zhì)需要進(jìn)一步純化需要根據(jù)蛋白質(zhì)的用途確定。

12) 純化的目標(biāo)蛋白質(zhì)需要復(fù)性，復(fù)性常用的手段可以參考有關(guān)手冊(cè)確定的原則。

GuNTA-0 、20、40、60、100、500Buffer分別為濃度20 mM Tris-HCl pH7.9, 0.5 M NaCl, 10% Glycerol,6 M Guanidium HCl添加0、20、40、60、100、500 mM Imidazole。

C. NTA樹脂的再生

NTA樹脂在使用若干次數(shù)（3-5次）后，結(jié)合效率有所下降，可以用以下方法再生，提高樹脂的使用壽命和蛋白質(zhì)的結(jié)合效率。

NTA樹脂再生前需要從層析柱下端流干所有溶液，估計(jì)出NTA的樹脂體積，按下列次序?qū)⒃偕噭┘拥綄游鲋铮诘壬弦徊皆偕芤毫鞲珊?，再加下一步再生溶解?/p>

用戶需要自行準(zhǔn)備25%、50%、75%、100%（v/v）乙醇和去離子水。 從層析柱下端流干所有溶液，用2倍NTA樹脂體積的Stripping Solution I、2倍體積的去離子水、3倍體積的Stripping Solution II、1倍體積的25%乙醇、1倍體積的50%乙醇、1倍體積的75%乙醇、5倍體積的100%乙醇、1倍體積的75%乙醇、1倍體積的50%乙醇、1倍體積的25%乙醇、1倍體積的去離子水、5倍體積的Stripping Solution III、3倍體積的去離子水分別洗一遍。

如果立即使用，用5倍體積的Ni Charging Solution洗，再用10倍體積的平衡溶液（NTA-0Buffer或GuNTA-0 Buffer）洗；如果想長期儲(chǔ)存，加入1倍體積的20%乙醇，4°C保存，使用前用5倍體積的Ni Charging Solution洗，再用10倍體積的平衡溶液（NTA-0Buffer或GuNTA-0 Buffer）洗

再生溶液配方：Stripping Solution I:  6M GuHCl, 0.2M acetic acid。Stripping Solution II: 2% SDS。        Stripping Solution III: 100 mM EDTA, pH 8.0。Ni Charging Solution: 100 mM NiSO4

  備注：產(chǎn)品信息可能會(huì)有優(yōu)化升級(jí)。請(qǐng)以實(shí)際標(biāo)簽信息為準(zhǔn)。

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標(biāo)題:An LcMYB111-LcHY5 Module Differentially Activates an LcFLS Promoter in Different Litchi Cultivars

成員:Zhidan Xiao, Jing Wang, Nonghui Jiang, Chao Fan, Xu Xiang, Wei Liu

論文因子:5.6 發(fā)表期刊:INTERNATIONAL JOURNAL OF MOLECULAR SCIENCES pmid:38069137

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標(biāo)題:A novel phage carrying capsule depolymerase effectively relieves pneumonia caused by multidrug-resistant Klebsiella aerogenes

成員:Cui Xiaohu, Du Bing, Feng Junxia, Feng Yanling, Fan Zheng, Chen Jinfeng, Cui Jinghua, Gan Lin, Fu Tongtong, Tian Ziyan, Zhang Rui, Yan Chao, Zhao Hanqing, Xu Wenjian, Xu Ziying, Yu Zihui, Ding Zanbo, Li Zhoufei, Chen Yujie, Xue Guanhua, Yuan Jing

論文因子:11 發(fā)表期刊:JOURNAL OF BIOMEDICAL SCIENCE pmid:37653407

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標(biāo)題:Intervention effects of Trichinella spiralis excretory-secretory antigens on allergic asthma in mice

成員:Jing-Bo Zhen, Jin-Peng Zhang, Feng Sun, Li-Hao Lin, Yu-Heng Zhang, Rui-Biao Wang, Yang Han, Zhi-Xin Li, Yi-Xin Lu

論文因子:5.714 發(fā)表期刊:INTERNATIONAL IMMUNOPHARMACOLOGY pmid:37058749

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標(biāo)題:The P-body component DECAPPING5 and the floral repressor SISTER OF FCA regulate FLOWERING LOCUS C transcription in Arabidopsis

成員:Wang Wanyi, Wang Chuanhong, Wang Yunhe, Ma Jing, Wang Tengyue, Tao Zhen, Liu Peipei, Li Shuai, Hu Yuanyuan, Gu Aiju, Wang Hui, Qiu Chunhong, Li Peijin

論文因子:12.085 發(fā)表期刊:PLANT CELL pmid:37220754

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標(biāo)題:Cardiac patches made of brown adipose-derived stem cell sheets and conductive electrospun nanofibers restore infarcted heart for ischemic myocardial infarction

成員:Jinxin Li, Fengli Liu, Zhihao Ren, Guanghua Fu, Jizhen Shi, Naiyu Zhao, Yu Huang, Jingliang Su

論文因子:5.2 發(fā)表期刊:Frontiers in Microbiology pmid:37426000

注意：以上文獻(xiàn) 僅供參考

鎳-瓊脂糖凝膠6FF

鎳-瓊脂糖凝膠6FF